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過度磷酸化TDP-43蛋白在神經退化疾病的機制現形

本中心陳韻如研究員長期投入在與蛋白質錯誤折疊相關的神經退化性疾病研究。2014年,團隊首度證明額顳葉失智症 (Frontotemporal lobar dementia, FTLD) 患者的腦組織中有TDP-43蛋白球狀寡聚體(TDP-43 oligomers)且具有神經毒性;並和乙型類澱粉蛋白(Amyloid-β)具有關連性(研究報導:TDP-43 是讓阿茲海默症加速惡化的幫手)。2020年,進一步發現TDP-43蛋白球狀寡聚體對於阿茲海默症(AD)惡化有加成效果(研究報導:TDP-43蛋白球狀多聚體是一導致失憶症的關鍵分子)。從額顳葉失智症到阿茲海默症都證實全長TDP-43蛋白是導致腦神經退化病變的主要關鍵之一。

陳韻如老師也觀察到,在患有額顳葉失智症和漸凍症的病人檢體中,過度磷酸化的TDP-43蛋白也會大量表現。『既然如此,那一定是還有甚麼未知的機制!』出自於好奇,開啟團隊更近一步的探索。

最近,研究團隊在美國化學學會出版的《ACS化學神經科學》(ACS Chemical Neuroscience)期刊發表論文,發現在蛋白質C端過度磷酸化的TDP-43會促使其形成類澱粉蛋白纖維(amyloid fibrils),且在蛋白的堆積過程中,當球狀寡聚體形成時才會對神經釋放毒性。本篇論文同時獲選為該期刊之9月的期刊次封面。

 

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TDP-43蛋白與C端過度磷酸化的TDP-43蛋白的沈澱機制意示圖

 

研究人員先製作並純化出幾種TDP-43蛋白變異株。其中包含野生型(wild-type),及將其位於C端379、403、404、409和410,這五個與神經退化疾病息息相關的絲氨酸位點置換為天門冬氨酸(aspartic acid),以模擬過度磷酸化的TDP-43蛋白(serine-to-aspartate mutant,以下簡稱S5D),並在相同的五個位置替換成丙胺酸(alanine),以模擬無磷酸化的TDP-43蛋白(serine-to-alanine mutant,以下簡稱S5A),作為對照組。

研究團隊率先提出第一個假說:過度磷酸化是不是引發毒性階段的關鍵因子。

然而,在抗體測試與穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)攝影等實驗的結果顯示,三個研究標的物皆有TDP-43蛋白球狀寡聚體的蹤跡。

 

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穿透式電子顯微鏡影像攝影,球狀體即是具毒性的TDP-43蛋白球狀寡聚體

 

接著,研究團隊發現三種型態的TDP-43蛋白,皆會凝聚出不同程度的球狀液態冷凝物(liquid-like condensates)。與其他兩者相比,S5D不但可溶性高且具動態性。

研究團隊懷疑或許S5D跟許多神經退化性疾病具有共同的病理特徵,即自發性形成富含cross-β-sheet結構的蛋白質纖維(fibril),例如:阿茲海默症病變的關鍵蛋白乙型類澱粉蛋白(Amyloid-β, 即Aβ)。結果,的確!在類澱粉蛋白專一的螢光探針-硫磺素T (Thioflavin T) 實驗中,團隊發現S5D表現出經典的類澱粉纖維動力學,但野生型和S5A不會。在TEM的攝影中,野生型TDP-43與S5A的沈澱物像是一圈圈不規則的形體堆積成團,團隊稱之為無定形聚集體(amorphous aggregates)型態。反之,S5D的沈澱物外型呈現纖維狀結構。

 

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硫磺素T染色螢光探測訊號、免疫染色與穿透式電子顯微鏡攝影

 

已知,TDP-43蛋白堆積所造成的TDP-43蛋白球狀寡聚體會對神經產生毒性,科學家思考,沉澱物的最終形態同樣也具有毒性嗎?答案是,沒有!研究團隊取用大鼠的初代神經細胞,分別放入wild-type TDP-43、S5D與S5A的蛋白球狀寡聚體與其最終的沈澱物,發現只有在產生球狀寡聚體的階段才會釋放出神經毒性。此研究首次比較TDP-43蛋白堆積物種的毒性,並證實球狀寡聚體才是真正具有神經毒性的物種!

2014年八月開始的慈善活動-冰桶挑戰(Ice Bucket Challenge)與同年十一月上映的電影-愛的萬物論(The Theory of Everything)的相互加成下,喚起大眾對腦神經退化疾病如漸凍症議題的注目與廣泛討論,而目前仍未找到針對這類疾病的早期診斷與後續治療的方向。「不管人生多困難,只要活著,就有希望。」(However bad life may seem, while there is life, there is hope.)患有漸凍症的英國著名物理學家史蒂芬霍金(Steven Hawking)是這麼說的。研究團隊希望發掘更多基礎科學的細節,拋磚引玉,提供在神經退行性疾病中有關TDP-43蛋白標靶治療的線索。

 

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獲選為ACS Chemical Neuroscience 2022年9月的期刊次封面。
研究團隊(左到右):助理黃詩涵、陳韻如老師、TIGP博士候選人賴煜升

 

本研究的第一作者為研究助理江宛芹(Wan-Chin Chiang)與清華大學博士生方裕勝(Dr. Yu-Sheng Fang),目前方裕勝已取得博士學位受聘於生技公司,江宛芹至國外繼續攻讀博士學位。論文第二作者賴煜升為中研院國際研究生跨領域神經科學學程博士班研究生。其他貢獻者有翁子玉博士,助理Kiruthika Ganesan,助理黃詩涵,助理張藍云,學生周士傑。本次的研究論文「Hyperphosphorylation-Mimetic TDP-43 Drives Amyloid Formation and Possesses Neuronal Toxicity at the Oligomeric Stage」可在線上閱讀:https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acschemneuro.1c00873

 

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